盧敏^1,2  白杰¹  魏鳳仙¹  徐彬¹  尹清強²  李紹鈺[1]^*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002)

摘  要：為了實現(xiàn)原核表達的途徑高效獲取抗菌肽蛋白，以RT-PCR的方法反轉(zhuǎn)錄合成家蠅的抗菌肽diptericin基因，并克隆至pGEX-4T-1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21宿主菌進行表達。測序結(jié)果顯示RT-PCR克隆到長345 bp的家蠅diptericin基因，重組菌經(jīng)異丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導后，通過SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測到目的蛋白的融合表達，結(jié)果表明帶有GST標簽的融合蛋白大小約為37 KDa，并且通過GST純化柱純化得到了目的蛋白。

關(guān)鍵詞：家蠅；抗菌肽；diptericin；原核表達

Expression of Diptericin Gene from Housefly(Musca Domestica) in E. coli

Lu Min^1,2  Bai Jie¹  Wei Fengxian¹    Xu Bin¹  Yin Qingqiang²  Li Shaoyu¹*

(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)

Abstract: To expression antibacterial peptide by prokaryotic expression, diptericin gene was obtained by RT-PCR method from housefly. Then, diptericin gene was cloned to PGEX-4T-1 expression vector and transformed into E. coli BL21 for protein expression. Sequencing result showed that housefly diptericin gene was 345 nucleotides in length, recombinant PGEX-4T-1 was induced by IPTG and the expression of diptericin fusion protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis and Western-blot. Result showed that diptericin fusion protein with GST label was about 37 KDa. And the diptericin fusion protein has been purified by GST protein purification column.

Keywords: housefly; antibacterial peptide; diptericin; prokaryotic expression

 

    抗菌肽（Antibacterial peptide）是生物體內(nèi)具有免疫屏障作用的一類多肽，是天然免疫系統(tǒng)中不可缺少的重要組成部分^[1]。自20世紀70年代末Boman等首次在惜古天蠶（Hyalopbora cecropia）中發(fā)現(xiàn)抗菌肽天蠶素（cecropin）以來，迄今已有1000多種具有抗菌活性的多肽被分離鑒定^[2]，且來源于昆蟲的抗菌肽就有200多種。由于抗菌肽一般都具有抗細菌的活性，有的還具有抗病毒、抗原蟲及抑制和殺傷腫瘤細胞等活性，并且具有熱穩(wěn)定性好、對正常細胞沒有損害、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，所以成為人們關(guān)注的熱點。

家蠅能夠在惡劣的環(huán)境中生存，在其長期抵御微生物的侵襲中形成了其獨特的免疫系統(tǒng)，對于家蠅抗菌肽的研究越來越多，其中研究較詳細的有attacin、defensin、cecropin，而對雙翅肽diptericin的研究較少。從昆蟲體內(nèi)提取天然抗菌肽的得率少，生產(chǎn)成本高，因此，構(gòu)建基因工程菌來實現(xiàn)抗菌肽的高效表達成為人們研究的熱點。本研究從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆得到diptericin基因，與PGEX-4T-1載體連接后，在大腸桿菌BL21中得到表達，為后續(xù)篩選可以高效表達diptericin蛋白的基因工程菌提供基礎。

 

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和試劑

    家蠅 Musca domestica 種蠅由河南省疾病預防控制中心惠贈，幼蟲由本實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25℃，相對濕度50 % ~ 70 %；大腸桿菌DH5α、BL21購自天根生物生化科技有限公司，克隆質(zhì)粒PMD19-T購自寶生物工程有限公司；大腸桿菌ATCC-25922和表達質(zhì)粒PGEX-4T-1由本實驗室保存。

GSTrap HP，1 ml 購自GE Healthcare Life Sciences，RNAiso Plus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、蛋白質(zhì)分子量標準、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取和DNA純化回收試劑盒購自天根生物科技有限公司，其它試劑為國產(chǎn)和進口分析純。PCR引物合成及DNA序列測定由上海生物工程技術(shù)服務有限公司完成。

1.2方法

1.2.1 家蠅幼蟲總RNA的提取 微生物刺激家蠅：培養(yǎng)大腸桿菌ATCC-25922至OD 600=0.6~0.8，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次后重懸，最終OD 600=1.8~2.0。選取大小均一、活動能力強的家蠅3日齡幼蟲，用帶有大腸桿菌的針刺破家蠅幼蟲后三分之一，飼養(yǎng)6 h后收集幼蟲于液氮保存?？?/SPAN>RNA提?。簩⒂紫x于液氮研磨后，加入RNAiso Plus，提取總RNA（具體步驟按照RNAiso Plus試劑盒說明書），用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并測定RNA濃度及純度。

1.2.2 RT-PCR克隆家蠅抗菌肽diptericin基因 從GeneBank中查到家蠅diptericin基因mRNA序列（Genebank ID：FJ795370.1），在其編碼區(qū)設計引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物引入XhoⅠ酶切位點，并加入27堿基的HA標簽序列。

P1：5'-TTAGAATTCAACAAAATGAAATATCTCTGGGCCATTGTTC-3'

P2: 5'-TATCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACCATCTGTAGGTATAA C-3'

以提取的總RNA為模板，用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄過程嚴格參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1st-strand cDNA合成的操作方法。以cDNA為模板，P1、P2為引物，擴增家蠅diptericin基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4 DNA連接酶作用下與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用藍白斑篩選方法篩選陽性克隆，具體方法參照《分子克隆實驗指南》^[3]第15章。挑選陽性克隆進行菌落PCR鑒定、EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定后的陽性克隆送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 PGEX-4T-1-diptericin重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組克隆PMD19-T-diptericin質(zhì)粒和表達載體質(zhì)粒PGEX-4T-1同時進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，并純化回收diptericin基因和PGEX-4T-1質(zhì)粒，回收產(chǎn)物經(jīng)T4 -DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，利用轉(zhuǎn)化子的AMP抗性在LB平板上進行篩選，陽性克隆進行質(zhì)粒PCR鑒定及雙酶切鑒定，并進行測序，確定有正確的閱讀框，無堿基突變后進行下步實驗。

1.2.4 diptericin基因的融合表達 從平板上挑取PGEX-4T-1-diptericin-BL21的單克隆菌落，接種于3 ml含有AMP的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，第二天按照1:100接種于100 ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD 600=0.6~0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導4 h。離心收集菌體，在冰上進行超聲破碎，條件：300 w，超聲4 s，間隔4 s，10分鐘。破碎之后離心收集上清液。將上清液與等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴3~5 min，取8 μL進行SDS-PAGE電泳檢測，以轉(zhuǎn)化有空質(zhì)粒PGEX-4T-1的大腸桿菌BL21為對照。SDS-PAGE蛋白電泳參照《分子克隆實驗指南》第5章，蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍R-250染色，使用的分離膠濃度為12 %。

1.2.5 Western-blot檢測 目的蛋白中引入了HA標簽，用此標簽進行Western-blot檢測目的蛋白，一抗：小鼠源 Anti-HA antibody，二抗：熒光素標記羊抗鼠IgG。經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，去除濃縮膠，照分離膠尺寸剪好濾紙和硝酸纖維素膜（NC膜），并將其與電轉(zhuǎn)移裝置配套的海綿墊置于轉(zhuǎn)移緩沖液平衡10 min。安裝好電轉(zhuǎn)移裝置后，冰浴條件下3 W轉(zhuǎn)移1 h 50 min。將NC膜用封閉液封閉2h，一抗在室溫下孵育1～2 h，二抗室溫孵育1 h，用Odessey熒光WB檢測系統(tǒng)掃描圖片。

1.2.6 diptericin-GST融合蛋白的純化 將重組PGEX-4T-1-diptericin-BL21大腸桿菌誘導表達后，離心取菌體沉淀進行超聲破碎，取上清液用0.45 μm的過濾器進行過濾。按照GSTrap HP 1 ml純化柱操作方法進行純化，并進行SDS-PAGE電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 家蠅幼蟲總RNA的提取與RT-PCR擴增diptericin基因

本試驗用RNAiso Plus試劑提取家蠅幼蟲總RNA，經(jīng)電泳檢測條帶清晰完整性好，OD260/OD280在1.8~2.0之間純度好，這為后續(xù)試驗順利進行奠定了基礎。RT-PCR擴增diptericin基因，從電泳結(jié)果可以看出，擴增產(chǎn)物大小在350bp左右，與預計的結(jié)果相符，見圖1。

1  2   3   4   M

600 450 300 150

bp 1200 900 750

 

圖1 RT-PCR擴增diptericin基因

                      Fig.1 RT- PCR products of diptericin gene

注：M, DNA Marker; 1~4, diptericin 基因

 

2.2 重組菌PGEX-4T-1-diptericin-BL21的鑒定

提取陽性克隆質(zhì)粒，進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，出現(xiàn)了大小約為4.9 kb和350 bp的兩條帶，表明重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-diptericin構(gòu)建成功，見圖2。將通過鑒定的質(zhì)粒送至上海生物技術(shù)服務有限公司測序，分析測序結(jié)果，選取插入方向正確，具有正確的閱讀框，無堿基突變的重組菌。測序結(jié)果顯示，含有酶切位點及HA標簽序列的diptericin基因長為345 bp，diptericin基因與Genbank中已公布diptericin序列的同源性最高達到99.9 %，對其編碼蛋白進行分析，diptericin基因編碼99個氨基酸，分子量約為10.796 kDa。

M      1     2

 

bp 600－ 450－ 300－ 150－

         圖2 重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-diptericin雙酶切鑒定

                                            Fig. 2 The double digestion results of PGEX-4T-1-diptericin

                            注：M, DNA Marker；1、2, 重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-diptericin雙酶切

2.3 家蠅diptericin融合蛋白誘導表達及檢測

     挑選重組PGEX-4T-1-diptericin-BL21的單菌落進行誘導表達，細胞破碎后提取上清，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，同時將大腸桿菌BL21和含有空質(zhì)粒的大腸桿菌PGEX-4T-1-BL21作為對照，電泳結(jié)果如圖3所示，目的蛋白為帶有GST標簽的diptericin蛋白，大約在37 KDa，與理論大小相符，而對照組此位置均無條帶，PGEX-4T-1-BL21經(jīng)誘導后在大小約為26 KDa處有明顯條帶，應為GST標簽蛋白條帶。

KDa 97.2 66.4   44.3     29.0     20.1

1   2   3   4   5   M

目的條帶

                                  圖3 重組diptericin基因表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳

                                       Fig.3 The SDS-PAGE of diptericin gene expression product

注：M, 蛋白分子質(zhì)量標準; 1, 大腸桿菌BL21; 2, 大腸桿菌PGEX-4T-1-BL21; 3, 大腸桿菌PGEX-4T-1-BL21誘導上清; 4, PGEX-4T-1-diptericin-BL21未誘導上清; 5, PGEX-4T-1-BL21誘導表達破碎上清

2.4  Western-blot檢測

從圖4可以看出，通過HA抗體進行Western-blot檢測，PGEX-4T-1-diptericin-BL21誘導后有單一條帶的目的蛋白，而對照組PGEX-4T-1-BL21無條帶，表明diptericin基因成功在大腸桿菌BL21中得到了表達。

 

 

 

75KDa 63KDa 48KDa 35KDa   25KDa 20KDa

M   1   2

          圖4 重組diptericin蛋白western-blot檢測

     Fig.4 The western-blot of diptericin

                              注：M, 蛋白分子質(zhì)量標準; 1, 大腸桿菌PGEX-4T-1-BL21; 2, PGEX-4T-1-diptericin-BL21

 

2.5重組蛋白純化

收集PGEX-4T-1-diptericin-BL21誘導表達后的菌體超聲破碎上清，通過GSTrap HP 1 ml純化柱純化目的蛋白，將洗脫緩沖液洗脫后的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，見圖5，可以看到，通過GST純化柱純化到了目的蛋白，顯示為單一條帶，大小約37 KDa。

M  1  2

97.2 KDa 66.4 KDa   44.3 KDa     29.0 KDa

 

 

  圖5 重組diptericin蛋白的純化

Fig.5 Purification of diptericin

                            注：M, 蛋白分子質(zhì)量標準; 1-2, diptericin-GST融合蛋白純化

 

3 討論

已有許多學者對構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)抗菌肽進行了研究，包括原核表達和真核表達，如Liang等^[4]利用將家蠅Cecropin基因克隆到PGEX-4T-1載體上，實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的融合表達，切除GST標簽后的Cecropin蛋白對大腸桿菌具有一定的抑菌效果，李小波^[5]等將家蠅抗菌肽attacin克隆至酵母表達載體pPIC9K中，實現(xiàn)其在畢赤酵母GS115中的表達。雙翅肽(diptericin)最早由Dimarcq等^[6]從經(jīng)細菌誘導的新陸原伏蠅Phormia terranovae 幼蟲的血淋巴中分離得到，并證實其參與昆蟲的體液免疫防御且發(fā)揮著十分重要作用。然而，對于家蠅diptericin基因的研究并不多。

抗菌肽對蛋白酶非常敏感，而且表達抗菌肽對宿主菌可能具有毒性或者表達的抗菌肽無活性^[7]，以融合蛋白的形式表達抗菌肽目的基因，可以減少抗菌肽本身對宿主菌的毒害作用，同時還能保護抗菌肽蛋白避免蛋白酶的降解^[8]。PGEX-4T-1是目前較多使用的表達載體，它利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因和目的基因連接，能夠在大腸桿菌中產(chǎn)生GST融合蛋白，并且可以用凝血酶進行切割GST蛋白而獲得目的基因產(chǎn)物。徐建華^[9]等將家蠅Attacin基因分別克隆至原核表達載體pET30a(+)和pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，從pET30a(+)/Attacin重組質(zhì)粒的表達宿主菌中未能獲得His-Attacin融合蛋白，而從pGEX-4T-1/Attacin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌種獲得了GST-Attacin融合蛋白。舒梅^[10]等將水生動物抗菌肽Y18和CEC1分別克隆到pGEX-4T-1載體上，構(gòu)建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1兩個融合蛋白表達載體，獲得了抗菌肽Y18和CEC1，并發(fā)現(xiàn)融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、S. aureus、B. subtilis和S. cerevisiae的生長。

因此，本研究將家蠅diptericin基因克隆至PGEX-4T-1載體中，對重組大腸桿菌進行IPTG誘導，通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測到大小約為37 KDa的目的蛋白，western-blot也檢測到單一蛋白條帶，說明diptericin基因在大腸桿菌中進行了融合表達。經(jīng)過純化，得到了含有GST標簽的diptericin融合蛋白，以融合蛋白形式表達的diptericin蛋白對宿主菌沒有明顯的抑制生長作用，后續(xù)試驗將通過切除GST標簽來檢測diptericin蛋白的生物活性，并通過研究不同誘導時間、溫度等條件來改善目的基因的表達，以期篩選到可以高效表達diptericin蛋白的重組基因工程菌。

抗菌肽有不同的種類，通過將不同的抗菌肽串聯(lián)進行表達有望得到活性更高的雜合抗菌肽，如陳玉海^[11]等將非洲爪蟾皮膚分泌的兩種種抗菌肽magaininⅡ和PGLa在畢赤酵母中進行雜合表達，構(gòu)建了雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的分泌型畢赤酵母表達載體，實現(xiàn)了雜合抗菌肽在畢赤酵母中的分泌表達。因此，今后可將不同的家蠅抗菌肽基因進行串聯(lián)表達，獲得抗菌譜更廣，活性更好的基因工程抗菌肽蛋白。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了家蠅diptericin基因原核表達載體PGEX-4T-1-diptericin-BL21，在大腸桿菌BL21中獲得了該蛋白的可溶性表達，經(jīng)過GST標簽純化柱純化得到了diptericin蛋白，為高效表達該蛋白提供了前期基礎。

參考文獻

[1] Hoffmann J A, Kafatos F C, Janeway C A Jr, et al. Phylogenetic perspectives in innate immunity[J]. Science, 1999, 284 (5418) :1313-1318.

[2] Bulet P, Stcklin R, Menin L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates[J]. Immunol Rev, 2004, 198(1): 169-184.

[3] 薩姆布魯克 J, 拉塞爾 DW. 分子克隆實驗指南[M]. 第三版. 黃培堂, 譯. 北京: 科學出版社, 2008.

[4] Liang Y, Wang J, Zhao X, et al. Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly(Musca domestica) and its expression in E. coli[J]. Dev Comp Immunol, 2006, 30 (3):249-257.

[5] 李小波, 王婷婷, 馬艷, 等. 家蠅抗菌肽Attacin在畢赤酵母中的異源表達[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2010, 28(5):332-336.

[6] Dimarco JL, Keppi E, Dunbar B, et al. Purification and characterization of a family of novel inducible antibacterial proteins from immunized larvae of the dipteran Phormia terranovae and complete amino-acid sequence of the predominant member, diptericin A [J]. Eur J Biochem, 1988, 171(1-2): 17-22.

[7] 楊小蓉, 金小寶, 丁彩屏, 等. 家蠅幼蟲抗菌肽diptericin-2基因的克隆及原核表達-鑒定[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2012,39(11): 2791-2793.

[8] Chen H, Xu Z, Xu N, et al. Efficient production of a soluble fusion protein containing human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system[J]. J Biotechnol. 2005, 115(3):307-315.

[9] 徐建華, 朱家勇, 金小寶, 等. 家蠅幼蟲抗菌肽Attacin基因的克隆表達及抑菌生物學活性[J]. 醫(yī)學分子生物學雜志, 2007, 4(1):20-26.

[10] 舒梅, 許楊, 徐熙, 等. 兩種水生動物抗菌肽的原核表達及活性分析[J]. 中國生物工程雜志, 2011, 31(2): 56-61.

[11] 陳玉海, 陳慶煌, 陳科, 等. 抗菌肽magaininⅡ的密碼子優(yōu)化及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達[J]. 生物工程學報, 2014, 30(4): 615-624.